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超实用！高通量活细胞自噬体定量分析新方案
277 人阅读发布时间：2025-07-10 15:27
自噬 (Autophagy) 作为细胞内源性保护机制，通过溶酶体途径降解并回收自身受损细胞器及错误折叠蛋白，其动态调控研究对癌症、神经退行性疾病及代谢综合征等重大疾病机制解析具有关键意义。目前体外模型评价自噬的检测手段包括电子显微镜、Western Bolt、构建 GFP-LC3 荧光报告蛋白的细胞株等方法，但是这些方法或为终点法检测、或需要较复杂的实验操作或者只适合特定细胞系。基于此，来自德国团队开发了一套基于 Cyto-ID® 染色 +Cytation 成像的绝对定量方案，轻松实现活细胞自噬体评价。
方案主要特点
- 活细胞中自噬小体的绝对定量
- 用于测定原代人皮肤成纤维细胞自噬的优化方案
- 可测试活性物质及治疗手段对自噬的影响
- 基于自动化成像技术的自噬测定方法
图：该方案主要的实验流程图
主要检测原理
使用 780-1400 nm 的红外光线辐照加热细胞至 39℃，诱导细胞产生自噬反应，CYTO-ID 自噬检测试剂盒的绿色染料能够特异性标记前自噬体、自噬体和自噬溶酶体，同时包含用于细胞核染色的 Hoechst 染料，以便能够清晰定位每个细胞。通过加自噬体降解抑制剂氯喹作为阳性对照。细胞标记后，通过荧光成像定量分析每个细胞的自噬体含量。
主要实验流程
1 细胞准备
- 使用原代人皮肤成纤维细胞（8 岁健康男性包皮来源，传代 8-9 次）
- 解冻 5×10⁶ 细胞，500×g 离解冻 0.5×10⁶ 细胞，离心后接种至 T175 瓶，培养 ≥48 小时恢复状态
- 96 孔板每孔接种 5,000 细胞（100 μL DMEM），静置 1 小时使均匀贴壁，培养 24 小时。
2 细胞分组和处理
2.1 分组处理：
- 对照组：6 孔加普通 DMEM，6 孔加 0.5 μM 氯喹（阳性对照）。
- 热疗组：同法分组，采用 IRAcubator（39℃ 红外-A 辐射，780-1400 nm）39℃ 处理 1 小时（对照组同步 37℃ 培养）。
- 注意：氯喹处理时间严格控制在 1 小时内。
2.2 CYTO-ID® 染色
- 弃上清，用 1× assay buffer 轻柔洗涤 2 次。
- 加入 100 μL 染色液（含 CYTO-ID® 绿染剂 +Hoechst 核染），避光孵育 30 分钟。
- 再次洗涤后，加 100 μL assay buffer 立即成像。
3 Cytation 成像与数据分析
设备：安捷伦 BioTek Cytation 1 细胞成像多功能微孔板检测仪 （备注：该方案兼容 Cytation 系列所有设备）
成像设置：20X 物镜下双通道捕获（DAPI 核信号+GFP 自噬体信号），每孔取 2 张中心区域图像。
图像处理：包括图像去背景、去卷积处理，以获得良好的用于分析的图像
图像分析：Primary Mask:识别细胞核（DAPI 信号）。Secondary Mask: 使用 Spot Count 功能统计核周自噬体数量（GFP 信号）。如下图所示图像处理后（A），在细胞核周围设置预定义的 mask（B1-B2）。软件自动统计 Mask 识别的每个细胞内的自噬体数量（B2）。
总结：为什么要选择这套流程？
标准化：该方案提供了从细胞处理到数据分析全流程 SOP。
✦绝对定量：自动化的成像方案保证在一致的成像条件下进行样本的定量分析，直接计算“自噬体/细胞核”数量，告别 Western Blot 的半定量模糊性。
✦活细胞友好：无需固定或裂解细胞，保持生理状态。
✦高通量：96 孔板设计，1 小时内完成多组平行检测，适合高通量筛选。
✦适配性强：可扩展至其他治疗（如药物筛选）或细胞类型（如 HeLa）。
✦低成本：相比其他复杂制样过程，该方案从染色到分析仅需两小时，且无需昂贵抗体或特殊耗材。
兼容性：可搭配 Cytation 的微孔板检测系统拓展多重检测（如细胞活力、ROS、线粒体膜电位等）。
应用潜力：目前此方案已应用于 ME/CFS 患者细胞研究，助力个性化热疗方案开发。
Cytation 系列检测平台能够提供多种灵活通量的标准化细胞筛选检测方案
参考文献
Hochecker, B. et al. (2024). Quantification of Autophagosomes in Human Fibroblasts Using Cyto-ID® Staining and Cytation Imaging. Bio-protocol 14(13): e5025. DOI: 10.21769/BioProtoc.5025.
关于安捷伦细胞分析
安捷伦细胞分析平台包括xCELLigence RTCA实时细胞分析仪、Novocyte系列流式细胞仪、Seahorse能量代谢分析仪以及Synergy系列微孔板检测仪和Cytation 系列（共聚焦）细胞成像多功能微孔板检测仪。安捷伦细胞分析平台聚焦基础科研与细胞与基因治疗产品的开发全流程，作为适配新一代疗法的强大分析工具，提供多方位的细胞效力检测和深度的细胞分析，并致力于研发、生产质控以及临床的全方位检测与分析方案开发。
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