卵巢癌研究进展 | Agilent BioTek Cytation助力PNPO在卵巢癌形成和PTX耐药机制上的研究

前言

卵巢癌（OC）是全球第二大致死性妇科恶性肿瘤，严重威胁女性健康及生活质量。有研究表明吡哆醇 5' - 磷酸氧化酶（PNPO）是卵巢癌的组织生物标志物，具有预后意义，但详细机制尚不清楚。

 

2024 年 4 月，复旦大学附属金山医院临床研究中心许国雄教授团队在 Apoptosis（IF：7.20）上发表题为“Targeting PNPO to suppress tumor growth via inhibiting autophagic flux and to reverse paclitaxel resistance in ovarian cancer”的研究论文。张凌云博士为该论文的共同通讯作者。

 

该研究首次证明了 PNPO 通过自噬通路影响卵巢癌的进展，并成为 PTX 耐药因子。PNPO的沉默通过影响溶酶体功能和分布来抑制自噬通路，在体外和体内均能有效抑制肿瘤形成并增强PTX敏感性。

 

 

 

 

研究结果

PNPO 过度表达是 OC 患者的预后因素

 

在 mRNA 和蛋白质水平上，OC 细胞中的 PNPO 均高于非癌性 IOSE-80 细胞。溶酶体、细胞周期、药物代谢、TGF-β 信号通路和 MAPK 信号通路一些基因的富集与 PNPO 在 OC 中的表达相关。PNPO 水平高的患者 OS 和无进展生存率较低。

PNPO 通过调节细胞周期蛋白 B1 和磷酸化 CDK1 与 OC 细胞增殖呈正相关

 

通过使用 BioTek Epoch微孔板分光光度计结合 CCK-8 试剂盒在 450nm 的光密度下测量细胞的吸光度值，研究者发现 OVCAR-3 和 SK-OV-3 的细胞活力随着 PNPO 的knockdown而下调，PNPO 的过表达而上调。PNPO 的过表达显著缩短了 G2M 期，这表明 OC 细胞向有丝分裂的转变更快，从而加速细胞生长。

 

图 2. PNPO 对 OVCAR-3 和 SK-OV-3 细胞生长的影响

过表达的 PNPO 增强溶酶体的生物合成和核周分布

 

在 OVCAR-3 和 SK-OV-3 细胞中，溶酶体 PH 相关、酶活性相关、膜相关的基因，如 LAMP1、PSAP、CTSA、CTSG、ATP6AP1 和 ATP6V1E1，随着 PNPO 的上调而增加，PNPO 的下调而降低。LAMP2 是溶酶体膜上的典型分子，与 PNPO 呈正相关。作者使用 BioTek Cytation C10 共聚焦微孔板成像检测系统（Agilent technologies）通过免疫荧光染色证实了在 PNPO 过表达细胞中 LAMP2 蛋白的表达，表明 PNPO 的过表达可以诱导溶酶体的核周聚集。

 

图 3. PNPO 对卵巢癌细胞溶酶体生物合成和分布的影响

 

PNPO 促进自噬体的降解并增强 OC 细胞的自噬通量

 

在 OVCAR-3 和 SK-OV-3 细胞中，自噬蛋白 LC3-II 随着 PNPO 的过表达减少，PNPO 的knockdown而增加。有趣的是，研究者观察到 PNPO 促进核周分布和溶酶体的水解功能。溶酶体的核周分布有利于自噬体的降解。这些数据表明，PNPO 通过增加溶酶体的功能和核周分布来增强自噬通量。

 

图 4. PNPO 对卵巢癌细胞自噬的影响

LAMP2 在 OC 细胞中上调，与细胞存活呈负相关

在 OC 细胞中观察到 LAMP2 敲低后细胞活性的下降，在 OVCAR-3 和 SK-OV-3 细胞中，敲低 LMAP2 后凋亡细胞增加。这些数据表明，沉默 LAMP2 可能会抑制 OC 细胞生长并诱导 OC 细胞凋亡。

 

图 5. LAMP2-siRNA 对 OVCAR-3 和 SK-OV-3 细胞的影响

沉默 LAMP2 可阻断 OC 细胞中的 PNPO 作用

为了观察 EdU 实验检测到的结果，研究者使用 BioTek Cytation C10 共聚焦微孔板成像检测系统（Agilent Technologies）对细胞进行成像分析，过表达 PNPO 增加了 OC 细胞增殖。而在 OVCAR-3 和 SK-OV-3 细胞中，通过knockdown LAMP2 抑制了由过表达 PNPO 诱导的增殖。通过knockdown LAMP2 阻断了过表达 PNPO 诱导的溶酶体的核周聚集。上述试验表明，PNPO 的功能可能是通过调节自噬溶酶体实现的，确切的说是通过 LAMP2，这证明了 PNPO-LAMP2 轴的存在。

 

图 6. PNPO 对卵巢癌细胞行为和 LAMP2 自噬降解的影响

敲低 PNPO 通过抑制自噬通量来抑制异种肿瘤的形成

 

为了解 PNPO 在体外和体内肿瘤生长与自噬之间的关系，使用 CQ 作为自噬通量的抑制剂，通过 BioTek Epoch 微孔板分光光度计结合CCK-8 试剂盒（Beyotime），作者发现 50μM 的 CQ 降低了 OVCAR-3 和 SK-OV-3 细胞的活力，对细胞集落形成有抑制作用，且显著增加了细胞凋亡。knockdown PNPO 和 CQ 给药均显著抑制了 SK-OV-3 细胞异种移植肿瘤的生长，而 sh-PNPO 和 CQ 的联合使用协同了抑制作用。

 

图 7. 氯喹（CQ）对 PNPO 敲低作用的增强效果

PNPO 是 OC 细胞中对紫杉醇耐药的一个因素

通过分析研究者发现 PNPO 的表达与化疗药物敏感性有关。与紫杉醇敏感的细胞（A2780 和 OVCAR-3）相比，两个紫杉醇耐药细胞（A2780-PTX 和 OV3R-PTX）中 PNPO 的过表达。接着，作者构建了 PNPO - knockdown细胞系，及阴性对照 shRNA 细胞系 (sh-NC)。3D 培养显示，PNPO-shRNA 减小了细胞的微球大小，这表明通过敲低 PNPO 可以抑制细胞生长。

 

图 8. 通过knockdown PNPO 增强紫杉醇的敏感性

总结

OC 严重威胁女性的生命，对化疗的耐药性是 OC 进展的常见原因。本研究证明了 PNPO 对 OC 进展中自噬过程的调控机制，并且是一种 PTX 抗性因子。

 

在这项研究中，BioTek Cytation C10 共聚焦微孔板成像检测系统发挥了重要作用，通过这款小巧经济的共聚焦检测系统，获取了细胞完美的图像细节，结合BioTek Epoch 微孔板分光度计通过测量吸光度，对细胞活力进行快速、高灵敏度、无放射性的检测，为 PNPO 对溶酶体生物发生、自噬通量改变，OC 细胞增殖、肿瘤形成和 PTX 耐药的机制理解提供了宝贵的信息，阐明了通过靶向 PNPO 作为自噬抑制剂来抑制 OC 中的肿瘤生长和逆转 PTX 耐药的潜在应用价值。

 

原文链接：

Targeting PNPO to suppress tumor growth via inhibiting autophagic flux and to reverse paclitaxel resistance in ovarian cancer | Apoptosis (springer.com)