流例说 | Agilent NovoCyte Quanteon 流式细胞仪分析之Xdrop 液滴

这里我们展示 Xdrop 平台和 Agilent NovoCyte Quanteon 流式细胞仪联合分析 DE 液滴中的细胞或颗粒的方法和结果。

Xdrop 是一种液滴发生器，它与 Xdrop DE50 墨盒一起产生双乳液液滴 DE50 液滴。哺乳动物细胞或生物分子可以封装在体积约为 100 pL 的 DE50 中。荧光微球具有均匀的大小、形状和荧光特性，有助于优化流式细胞术中的散射和荧光参数，同时减少细胞异质性带来的影响，因而在本应用中封装荧光微球来展示如何通过流式细胞术分析 DE50 液滴。

使用含有 10% FBS（Sigma-Aldrich）、100 units/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素（Gibco）的 RPMI 培养基（Gibco），根据 Xdrop 手册制备三种不同的液滴样品（图 1.A）：仅包含 RPMI 培养基的未标记液滴，包含 FAM 标记的 DNA 探针（0.25 μM）（Integrated DNA Technologies）和培养基的对照液滴，红绿两种共封装荧光微球（2.5 μm AlignFlow Flow Cytometry Alignment Beads，Life Technologies）。不同的液滴显微镜下观察如图 1.B。

将液滴样本与由 650 μL dPBS （Gibco）、250 μL DE 稳定剂 D（Samplix）和100 μL OptiPrep（Stemcell Technologies）组成的流式稀释剂混合后用于流式分析。

图 1. A. 本研究中使用的液滴类型。含或不含酚红的未标记 DE50 液滴、含有 FAM 探针的液滴和带有共封装荧光微球的液滴。B. 显微镜下展示 A 中描述的 DE50 液滴；10 倍放大。

FAM 对照液滴用于鉴定 DE50 液滴种群（图 2）。DE50 液滴散射光信号如图所示，但样品压力、样品缓冲液、封装材料的尺寸和成分等因素改变时，散射光信号也会有所变化。DE50 液滴也包含纯载体油液滴，但油液滴既不影响分析，也不会影响流式细胞仪性能。

用 FAM 对照液滴的荧光信号（FITC）和散射光信号互相印证，可知 DE50 液滴比油滴有更高的 SSC。这样，DE50 液滴很容易与载体油滴分开。

图 2. 使用包含 FAM 标记的 DNA 液滴以及反向设门策略来确认流式图上 DE50 液滴的信号。A. 大多数 Xdrop 液滴产生的结果与此散射光信号相似。选中 SSC 较高的群体。B. 当在 FSC 与 FITC 图上展示 SSC 较高群体时，所有事件都是荧光的，这意味着它们包含 FAM 探针，是 DE50 液滴。C. SSC 较低的群体不发荧光，被识别为非 DE 液滴。

图 3. 用荧光鉴定 DE50 液滴。A. 未标记的空 DE 液滴：培养基不含酚红。B. 未标记的空 DE 液滴：培养基含酚红，酚红使液滴略微产生自发荧光。C. 仅包含（1）个红色微球的DE液滴（左上图象限）、（2）共封装的绿色和红色微球（右上象限）、（3）无微珠（空液滴 - 左下象限），（4）仅绿色微球（右下象限）。在 NovoCyte Quanteon 上对所有样品以相同的方式进行分析。