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酶标仪应用——使用无标记荧光偏振技术研究蛋白质构象和质量变化
51 人阅读发布时间：2025-12-04 14:12
蛋白质作为生命活动的主要承担者，在生物学、医学和生物技术等领域中扮演着至关重要的角色。为了深入理解和利用蛋白质的功能与特性，研究者们开发了一系列蛋白质表征方法，包括电泳法、色谱法、质谱法、光谱法、核磁共振等。
荧光偏振（ Fluorescence Polarization，FP）是一种基于酶标仪的高级荧光检测方法，通过外源荧光标记（如 FITC）或者内源荧光偏振光变化来研究蛋白质的构象变化和分子间相互作用。因为色氨酸本身具有荧光特性，在紫外线光谱范围内可被有效激发，如果您正在研究的蛋白质或者肽含有色氨酸，您可以参考本文使用安捷伦 BioTek Synergy H1 多功能酶标仪结合无标记荧光偏振技术来研究溶液中蛋白质的构象和质量变化。
荧光偏振检测原理
荧光偏振（FP）是一种荧光检测技术，其原理在于观察到荧光分子在受到水平方向偏振光激发时会发射水平方向偏振光。
在溶液中，蛋白质可以自由旋转，因此所发射的水平偏振光的方向会根据所使用荧光基团的荧光寿命以及该分子在该时间段内旋转的程度而发生变化。分子的旋转速度受溶液粘度、绝对温度、分子体积以及气体常数的影响。如果保持粘度和温度不变，那么旋转速度差异的关键变量就是分子体积，或者近似地说，就是分子量。
荧光偏振检测时需同步检测水平和垂直于激发偏振光方向的荧光强度来计算偏振值。任何荧光基团复合物的偏振值都与该复合物分子的旋转速度成反比。由于旋转速度与分子大小有关，因此大分子复合物偏振值较高，而小分子的偏振值较低。
传统方法常用荧光素或者罗丹明通过与肽或者核酸共价结合来作为示踪剂，而本文介绍的研究方法直接利用了蛋白质中色氨酸的天然荧光，因此无需任何化学修饰。
关于色氨酸的小知识
色氨酸具有吲哚环结构，最大吸收波长为 280nm，发射峰在 300-350nm 之间，具体取决于局部环境的极性。色氨酸是一种相对稀有的氨基酸，许多蛋白质仅含有一个或者几个色氨酸残基，因此，色氨酸荧光偏振可以作为单个色氨酸残基构象状态的灵敏测量指标。与外源探针相比，其优势在于蛋白质本身未发生改变。
材料与方法详见 Application Note（文末扫描二维码下载），我们直接来看数据与结果：
1.使用荧光偏振技术准确区分不同质量的分子
大分子和小分子混合物的荧光偏振值取决于它们的相对比例。大分子相对于小分子过量时，偏振值会较大；而小分子过量时，偏振值则较低。这一点通过将色氨酸氨基酸与人血清白蛋白（HSA）混合得到了证实。
图 2. 人血清白蛋白和色氨酸混合物在非变性条件下的偏振值。数据代表多次重复实验中至少 8 个独立测定的平均值和标准差。
HSA 是一种 67kD 的蛋白质，仅含一个色氨酸。但由于其体积较大，荧光偏振值会较高；相反，色氨酸氨基酸体积较小，偏振值较低。图 2 展示了使用BioTek Synergy H1 配备紫外偏振模块能够区分不同浓度比的色氨酸和 HSA 的能力。以 HSA 为主的混合物的偏振值约为 175 mP，而以色氨酸为主的混合物的偏振值约为 40 mP。
2.使用荧光偏振技术监测蛋白质去折叠
色氨酸通常位于蛋白质的疏水中心，作为三级结构的一部分，这极大地限制了其相对于整个肽链独立旋转的能力。如果三级结构完全变性，多肽链内的色氨酸部分在聚合物内具有一定的旋转自由度，而这种自由度是天然肽链不一定具备的。
图 3. 非变性状态与变性状态下的偏振值对比。在非变性条件或变性条件（8 M 胍盐或 10 M 尿素）下制备人血清白蛋白（HSA）与色氨酸的混合物，并测定其荧光偏振值。数据代表了来自多次实验的至少 8 个重复样本的平均值和标准偏差。
图 3 所示：在变性剂作用下，HSA 逐渐去折叠偏振值显著下降。与天然非变性条件下观察到的最大 FP 值相比，显著降低 40%。色氨酸含量较高的样品不受影响。
图 4. 随着胍盐浓度增加人血清白蛋白的偏振值变化情况。人血清白蛋白（HSA）用不同浓度的胍盐处理。孵育 30 分钟后，测定紫外激发下的偏振值。数据代表来自多次实验的至少 8 次独立测定的平均值。
图 4 则展示了蛋白质结构变化对荧光偏振的影响。当 HSA 暴露于不断增加浓度的变性剂时，偏振值起初约增加 10%，随后显著下降。这种增加是由于蛋白质初步展开，使其分子体积增大所致，而下降则归因于蛋白质完全展开，使色氨酸残基从蛋白质的疏水核心中释放出来，从而使吲哚环能够独立于蛋白质旋转。由于色氨酸仍是蛋白质主链的一部分，所以当蛋白质完全变性时，其偏振值仍显著高于溶液中的色氨酸。
3.使用荧光偏振技术追踪酶切过程
荧光偏振的本质在于能够区分质量差异。用蛋白酶消化 HSA 后，会使蛋白质逐渐分解成越来越小的肽段。由于 HSA 中只有一个色氨酸基团，所以只有含该氨基酸的肽段具有荧光性。如图 5 所示，在 100 μg/mL 或 500 μg/mL 蛋白酶消化 HAS 后，含色氨酸的肽段逐渐变短，偏振值随时间下降，而不含蛋白酶的样本则偏振值恒定，结果直观反映了酶切动力学。
图 5. 蛋白酶消化后 HAS 偏振值随时间的变化。在 37℃ 条件下，用 0、100、500 μg/mL 的蛋白酶处理（8 个重复），动力学测定荧光偏振。数据表示 8 个测定值的均值和标准差。
4. 使用荧光偏振技术检测聚合与组装
蜂毒肽（melittin）是从蜂毒中提取的一种由 26 个氨基酸残基组成的多肽，具有抑菌、抗病毒的作用，也常被用作研究蛋白质折叠。将 100 μM 蜂毒肽与不同浓度的氯化钠在 10mM 磷酸盐（pH 7.5）缓冲液中室温孵育 30min 后进行荧光偏振检测。结果显示：随着离子强度的增加，蜂毒肽从单体无规卷曲结构转变为 α-螺旋四聚体。形成二聚体和四聚体后，其旋转质量显著增加。荧光偏振检测结果实时地反映了其组装过程。
图 8. 蜂毒多聚体形成。在 pH 6.5 下，增加氯化钠浓度，孵育蜂毒肽 30 分钟，测定其荧光偏振度。数据表示八次测定的平均值。
在这篇应用指南中，Agilent BioTek Synergy H1 配合紫外偏振模块，为研究蛋白质结构和相互作用提供了一种无需标记、操作简便、结果可靠的方法。无论是构象变化、酶切过程，还是聚合组装，它都能让你“看得清楚，测得准确”。
说在最后
荧光偏振在多功能酶标仪的应用中属于一种高级荧光检测实验，需要特定的光学元件（例如起偏器）和高灵敏度的检测光路，安捷伦 BioTek Synergy H1 作为多功能酶标仪的“明星产品”，能够通过模块化配置，为荧光偏振、时间分辨荧光等高级荧光实验提供可靠结果。
安捷伦 BioTek Synergy H1 多功能微孔板检测仪
如果您对数据的平行性有更高的追求，推荐您选择拥有顶部双 PMT 检测器的多功能酶标仪型号 Synergy Neo2。Neo 2 顶部双 PMT 的设计在进行 FP 或者 HTRF 等实验中可以实现一次激发两次检测同时进行，而无需两次激发两次检测，检测速度更快的同时更好的保证数据的一致性、平行性和可靠性。
安捷伦 BioTek Synergy Neo 2 全功能微孔板检测仪
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文章来源：安捷伦细胞与基因组学公众号
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